PubChem（15分钟教你复现）

超详细2021年3分+ceRNA纯生信文章套路复现！

大家好！今天我们来复现2021年3月发表在Frontiers in Genetics 上的一篇ceRNA纯生信文章。ceRNA套路可咸可甜，影响因子可高可低，不会过时哟。本篇文章作者花样凑数据真真做得很好。让我们一起来品品吧。

期刊简介

本文脉络

复现工具

仙桃学术（https://www.xiantao.love/products）R & Rstudio：clusterProfiler，Venn（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）STRING (http://string-db.org)Cytoscape: STRING; MCODE; CytoHubbaGEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/)Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)Mirtarbase (http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/search.php#target)Starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/)Oncolnc (http://www.oncolnc.org/)Firehose database (http://firebrowse.org/)LncBase Predicted v.2 database (http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=lncbasev2/index-predicted)GSEA (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)Cmap（Connectivity Map）(https://portals.broadinstitute.org/cmap/) (https://clue.io/)PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)

文章复现

本文共10张图片和3个表格，我们跟随作者的脚步，一一进行。

Fig.1 作者向我们展示了本文的流程图，可以理解为基础文章中的模式图。

作者通过GEO数据库筛选自己想要的且合适的GSE50161，结合TCGA数据库TCGA-GBM，共两个数据集。一般我们会选择2-4个数据集，一个作为筛选数据集，1-3个作为验证数据集。本文思路：

本文思路

用两个数据集筛选共表达基因【挑】；进行GO/KEEGG，MCODE，筛选hub基因（8个）；Hub基因差异表达和生存分析，进一步筛选具有预后的hub基因（5个）；通过5个hub基因反向预测调控其的miRNA，并筛选hub miRNA（has-9-5p）；通过hub miRNA预测与其有交互作用的lncRNAs，并筛选hub lncRNA（10个）；只有CRNDE具有降低GBM OS的作用；mRNA-miRNA-lncRNA做成ceRNA模式；此外，作者用筛选到的具有预后hub基因中的三个做了单基因GSEA分析和治疗药物预测。

现在我们进入复现环节

Fig.2 筛选GSE50161和TCGA共表达差异基因 → 【表达差异(挑)】

做差异基因，挑是第一步，挑得好后面的模块做得才会好。挑这一步就算是老司机也要费不少时间的哟。

幸运的是我们现在有【仙桃学术】助力，【挑】有很多工作可以【仙桃学术】来实现：如差异分析和差异基因是否预后意义。

写在前面：GEO数据库的GEO2R功能拯救了很多不会R语言的学员，我们大师兄深深感受到了大家的渴望，开发出了比GEO2R更友好的数据集检索&分析板块。真真强烈推荐！！！

复现步骤

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进入仙桃学术→ 数据集检索(做自己的课题需要用自己的疾病/基因检索) → 挑选样本(可以随机选择样本哟) → 进入样本库 → 分组 → 进行差异分析。

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点击说明 → 查看差异分析结果及图表会发现，GEO2R有的功能和图，【仙桃学术】都有，包括样本信息，标准化处理后展示，PCA图，UMAP图，差异分析结果情况，很香的火山图和热图。重重重点是：图具有【细节修改】这一友好功能。觉得图不够美观，点【细节修改】；想要展示自己筛选的基因，点【细节修改】。爽歪歪有没有！！！

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Fig.2A火山图可直接使用，但美化下比较好：说明→细节修改或分析工具→数据集模块→火山图进入。GEO数据集相应的数据会在历史记录和【分析工具】的【数据集模块】展示，并助大家一臂之力，得到自己既想要又美观高大尚的图哟

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Fig.2B 热图展示了所有差异基因，目前仙桃学术数据集模块最多可以展示200个差异基因，【表达差异(挑)】的复杂热图可展示600个差异基因；我们就以top600差异基因为例来调整热图。下载GSE50161差异分析结果和表达矩阵 → 查看正常样本位置，正常样本位置需放在前面 → 获取top600差异基因表达谱数据 → 制作复杂热图。

提取top600差异基因表达谱数据并设置复杂热图相应的参数

进入仙桃学术，选择差异分析（挑）→复杂热图 → 下载示例数据 →根据示例数据调整GSE50161数据（见上图）→ 可视化展示

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对于Fig.2CD 我们有神操作哟，进入【仙桃学术】，选择差异分析→非配对样本分析→疾病选择TCGA-GBM(TPM数据)→点击确认，然后在说明文档【数据下载】→打开百度云超链接→下载TPM数据

TPM数据展示

下载的数据包括175个样本信息，有三种类型：原发性肿瘤，复发性肿瘤和正常样本，文中作者对于样本信息进行了筛选，只取原发性肿瘤和正常样本。

差异分析

多数分析工具和在线数据库（NetworkAnalyst）是对counts数据进行差异分析，所以对于TCGA FPKM和TPM数据进行差异分析还是绕不开R语言；解螺旋官网有很多R语言相关课程，在这里建议掌握简单的数据清洗；后续工作再在工具中进行。效率更高哟

TCGA-GBM差异分析我直接在R语言进行处理，差异分析结果展示(框中为我们后续分析需要的数据及上下调基因标识)：

火山图制作

按照【仙桃学术】火山图制作要求，从TCGA-GBM差异分析数据中提取火山图所需数据；然后用分离工具里的【表达差异（挑）】→ 【火山图】进行作图

作图 & 展示

Fig.2D热图制作同Fig.2B.

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Fig.2EF韦恩图制作：分别提取GSE50161和TCGA-GBM上下调基因 → 基础绘图 →韦恩图

上下调基因提取

韦恩图制作

方法一：Calculate and draw custom Venn diagrams（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）：以下调基因为例

缺点：下载后的数据所有的基因在同一列，不够体贴；韦恩图显示不全，需下载后调整。

方法二：仙桃学术；以上调基因为例，可以以同样的方式制作共表达下调基因韦恩图。根据韦恩图制作示例数据制作韦恩图所需数据：将GES50161上调基因和TCGA-GBM上调基因放在一个表格里即可。

韦恩图制作：仙桃学术支持制作6组数据集的韦恩图。直接用【仙桃】默认参数制作的韦恩图就很美观啦，不过为了配合作者的风格，我们对参数做了下调整，详细步骤标注在下图中。

我们在这里展示下共表达基因，这种格式显然比较舒服，后期提取共表达基因也会比较方便：复制黏贴就搞定了。

美美的Fig.2就完成啦！

Attention：TCGA前期数据处理借助于R语言比较好，建议学习一点数据清洗和差异分析的代码，需要的时候换下数据集就出来结果啦，其它的部分再用分析工具。

Fig.3 共表达基因GO/KEGG分析：

本图把得到的有统计学意义的差异基因，又分为上下调基因进行GO/KEGG分析，得到的图就会翻倍哟。一眼望去：图多，美容丰富。

复现步骤

上下调基因GO/KEGG分析为同样的方式，我们这里以上调基因为例

1

进入【仙桃学术】 → 【功能聚类（圈）】中的GO/KEGG富集分析 → 复制韦恩图中GSE50161和TCGA-GBM上调基因共表达基因至分子列表中，点击确认。参数里的【富集分析】一般选择默认，【全部GO/KEGG】已经最全了。

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下载GO/KEGG分析结果 → 选择文献中展示结果 → 复制GO/KEGG ID

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GO/KEGG可视化：必须做完GO/KEGG富集分析，才能做可视化，因为可视化用的是上一步GO/KEGG富集分析的结果。这步与上步不同的是，上步是获取上调基因富集到

了哪些生物过程，分子生物学功能，细胞学组分和通路。可视化是展示富集到的，我们想要的，感兴趣的和有价值的分析结果。可视化步骤详见下图：

注：GO是基因本体论联合会建立的一个数据库，旨在建立一个适用于各种物种的、对基因和蛋白功能进行限定和描述的，并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO注释分为三大类，分别是：分子生物学功能(Molecular Function，MF)、生物学过程(Biological Process，BP)和细胞学组分(Cellular Components，CC)，通过这三个功能大类，对一个基因的功能进行多方面的限定和描述。

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我们以相同的方式获得KEGG-UP和GO/KEGG-DOWN可视化结果

Attention：Fig.3D作者放错图了，操作时要注意哈

Fig.4 共表达基因进行MCODE分析

这一步主要是通过STRING数据库和Cytoscape结合完成；早期我们需要在STRING数据库网页上传共表达基因后，导出数据到Cytoscape进行绘图和美化；现在不需要进去STRING数据库了，Cytoscape就可以直接获取STRING数据库的数据了，只需要安装STRING插件。此外建议安装下STRING 富集分析插件，这样的话GO/KEGG分析都可以在Cytoscape完成哟。

复现步骤

1

提取GSE50161和TCGA-GBM所有共表达基因（上调+下调）list →打开Cytoscape→network页面→STRING→STRING protein query→复制黏贴共表达基因→生成网络图

2

点击搜索后，会出现下面的对话框，这里主要是：a. 对有疑问的基因做一个选择；b. 可信度调整：0.4为中可信度，还可以根据自己的结果再在后面步骤中做调整。

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上图中点击【Import】就出来下面漂亮的【STRING】元素的图啦。图中包含了很多信息，我们有设置Cytoscape的单元课，对Cytoscape感兴趣的童鞋可以系统学习；但通过以上三步也可以完成一张比较漂亮的图。

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MCODE分析：这部分我们直接上图哈

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Fig.4AB 选择第一个cluster→新建一个网络→调整参数

调整参数时，右侧框框中可以设置STRING数据库相应的参数，与在线数据局一样的，图片调整还会用到【layout tool】在下图的左下角，可以缩小和放大node的尺寸，以便获得更美观的图；图片中node太多时，比较好用。

对cluster 1所有基因进行功能富集

方法一：

直接在Cytoscape进行：选择所有的node → 右侧STRING参数框 nodes界面点击【功能富集】，确认后页面下方就会展示富集结果；这里不止是GO/KEGG结果，还会包括其它数据库的富集结果。

结果展示：

选择与文中一样的GO ID即可得到Fig.4B.

方法二：

获取cluster1（MCODE1）基因list ：将MCODE1的nodes（基因）全部导出

仙桃学术：GO/KEGG分析；GO/KEGG可视化，方法同Fig.3 这里不再赘述

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同样的方法获得Fig.4C-J

Fig.5 5个差异基因的生存分析结果

这就是我们常见的基因差异，单个基因在肿瘤和正常组织中表达有什么不一样很直观地展示出来；生存分析：作者选取的是四分位数，其它还有中位数、自定义比例，仙桃学术还有神仙操作：最小p值。

作者还就筛选到的5个基因进行GO富集分析。需要指出的是：目前就5个基因进行GO富集分析的在线数据库较少，但Metascape这个在线数据库可以。真真是：不管是黑猫白猫，能抓住老鼠的就是好猫。

复现步骤

差异分析和生存分析大家都比较熟悉了，这块我们直接上图哈

1

Fig.5 A-E (我们以ITGA5为例)

方法一

GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) 图片可直接用于发表，GEPIA这个数据库比较好用，相信大家也比较熟悉哈了，我们直接上图哈

1.差异表达

2.生存分析

方法二

仙桃学术（https://www.xiantao.love/products） 我们还是以ITGA5为例

1.差异分析

2. 生存分析

我们以同样的方式复现Fig.5 C-E

2

Fig.5 FG复现：

方法一

进入Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）→三步走（加载基因list → 选择物种 → 进行分析）

分析结果展示和下载

方法二

cytoscape → STRING → 基因富集（但结果与方法一差别较大），重点是我们掌握一种新方法。

Fig.6 5个差异表达基因（mRNA）反向预测miRNA

复现步骤 (我们以PTX3为例)

1

miRTarbase（http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php）→ search内输入基因名→下载结果

Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn/）→ miRNA-mRNA → 更改【target】

Starbase数据库界面友好，操作方便，比较推荐。

2

合并miRTarbase和Starbase数据库结果并保存

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制作miRNA_target nodes表格和miRNA_target属性表格

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Cytoscape→载入miRNA_靶基因和属性表格 → 生成网络并美化

Fig.7 用cytoscape插件cytohubba筛选与5个mRNA相关的miRNAs，并通过在线数据库Oncolnc分析筛选后的miRNA预后情况；→ 其中一个miRNA具有预后价值。

Cytoscape插件cytohubba是常用的筛选hub基因的一个插件，用起来很不错哟

Fig.7A 在Fig.6的基础上进行cytohubba筛选hub miRNA

1

首先选择目标网络（Fig.6）→ 点击【Calculate(计算)】→ 选择nodes（基因），可以像作者一样选择TOP9 miRNA(图片中选择TOP14是包括mRNA在内)；也可以选择自己感兴趣的基因，在⑦【特定的nods】里输入自己感兴趣的基因 → 点击【submit】，即可获得hub 基因，并生成新的网络。

2

Hub基因显示为不同的颜色

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选中top14 hub 基因，生成新的网络（Fig.7A），调整基因位置至美观（Fig.7A展示）

Fig.7B 复现

1

进入FIREHOSE（http://gdac.broadinstitute.org/）

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点击GBM那一行的【browse】，即可进入GBM具体数据显示页面

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在【view expression profile】输入has-9-5p，点击搜索小图标，进入has-9-5p分析页面

遗憾的是Has-mir-9-5p基因名称试了好多个都不行

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我们用其它基因（如：EGFR）展示一下，首先我们看到了EGFR在泛癌中表达情况；点击【filter】显示紫色框框中选项；点击【select none】；选择【GBM】;点击【submit】。即可获得EGFR在GBM中的表达差异

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EGFR在GBM中的表达差异展示

Fig.7C 复现

Oncolnc数据库页面非常简洁，我们进入后只需在框框中输入基因名称，点击【submit】即可进入基因在各个肿瘤中的情况列表

1

进入Oncolnc（http://www.oncolnc.org/）→输入hsa-9-5p → 提交

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Has-9-5p在21个肿瘤中的表达情况和生存分析情况 → 找到GBM所在行 →点击【Yes Please！】→ 进入has-9-5p生存分析页面

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首先会让输入高低组比例，我们输入50:50（即中位数）→点击【submit】即可显示Has-9-5p生存分析情况。

此处作者选的是中位数；也可以根据自己的数据自定义

Oncolnc数据库还很友好的列出了has-9-5p高表达组和低表达组的生存时间的状态。

Fig.8 由miRNA预测lncRNA，并用GEPIA数据库进行差异表达和预后分析 → lncRNA CRNDE 具有预后价值

Fig.8A复现：

作者通过Starbase和LncBase Predicted v.2两个数据库分别预测has-9-5p上游的lncRNA；然后取交集；进而筛选出更准确的lncRNA.

1

Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn/）→ miRNA-lncRNA → 更改【miRNA】为has-mir-9-5p → 更改【target】为all → 点击【Quick Search】→ 点击【Download】下载数据

2

LncBase Predicted v.2（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=lncbasev2%2Findex-predicted）→ 输入目标miRNA → 自动搜索并显示结果（简洁快速）→ 下载数据

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两个数据库下载数据展示：

Lncbase数据库下载的数据不太友好，它把ensemble号与基因名放在一起了；不过好在excel有【分列】功能

分列获取基因名：选中【ensemble号与基因名】→ 点击菜单栏【数据】里的【分列】→ 【（】作为分列标识 → 获得 【Gene_ID】和【Gene_Name）】两列 → 用同样的方式对【Gene_Name）】进行分列处理 → 得到蓝色框框中【Gene_Name】列。大功告成。

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方法一

Calculate and draw custom Venn diagrams（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）：

分别复制starbase和lncbase数据库基因list，并命名（左图）；然后点击【submit】就可以获得韦恩图（右图）啦

方法二

仙桃学术（https://www.xiantao.love/products）

1. 整理数据：分别复制starbase和lncbase数据库基因list，黏贴进excel中

2. 选择仙桃学术-分析工具 → 基础绘图 → 韦恩图→上传Fig.8A数据 → 调整参数 → 点击【确认】→ 韦恩图就好啦

Fig.8BC复现 本部分复现方法详细步骤见Fig.5，此处我们直接上图

方法一

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）

1.差异表达（同Fig.5）

2. 生存分析（同Fig.5）

方法二

仙桃学术（https://www.xiantao.love/products）

1.差异表达（同Fig.5）

2.生存分析（同Fig.5）

Fig.9 3个基因的单基因GSEA富集分析结果

Attention：相信做过GSEA的童鞋都受过GSEA数据制作的毒打，我也觉得很是麻烦，所以我们直接用【仙桃学术】哈。Fig.9A需要用Cytoscape。

复现步骤 (我们以PTX3为例)

1

单基因差异分析：生信工具_分析工具中的【表达差异挑（挑）】→【差异分析】→【单基因差异分析】→疾病选择【TCGA-GBM】→【分子】里输入“PTX3”，其他参数默认 → 点击【确认】→ 【结果】出显示分析结果。下载在历史记录里。

2

下载PTX3单基因差异分析结果&展示 → 提取PTX3 GSEA分析数据

3

PTX3 GSEA分析 和 数据下载&展示（操作方法及步骤同Fig.3）

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PTX3 GSEA可视化（操作方法及步骤同Fig.3）

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按照以上步骤复现Fig.9 B-D

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提取GSEA富集分析结果 → 制作网络图（Cytoscape）（Fig.9A）

1. 提取三个基因富集分析结果

2. 准备网络表格：excel复制黏贴即可

3. 打开Cytoscape并导入网络表格（同Fig.4）

网络展示

注：Cytoscape仅支持同时上传两个node列

4. 在Cytoscape 网络图界面添加两个node（has-9-5p和CRNDE）并命名：在网络图中单击右键→【add】→【node】→ 选中添加的node →单击右键 → 【edit】→ 【renamed node】→ 【输入has-9-5p/CRNDE】

5. node table自定义一列type → 分别标注 CRNDE, has-9-5p，（PTX3/MMP9/STX1A），通路为lncRNA, miRNA, mRNA和pa（pathway）→ 在【style】里更改node颜色 → 调整nodes 位置，即可得到美美的Fig.9A啦。

Fig.10 根据三个基因预测治疗GBM的三个药物

复现步骤

1

Cmap（https://portals.broadinstitute.org/cmap），用三个基因预测药物

制作三个基因的signature：需要的是基因的探针ID

2

获取基因探针ID并制作grp文件：打开GSE50161 差异分析结果 → 发现有探针列和基因列 → 点击【查找和替换】并输入STX1A进行查找即可获得STX1A的探针值 → 同样的方式获得MMP9和PTX3的探针值 → 将三个基因的探针值按照上下调基因分别复制黏贴到两个新的excel，保存后把后缀改成“.grp”即可。

上下调基因grp文件展示

3

点击【Query】→【quick query】→ 根据网页提示上传上下调文件 → 点击【execute query（执行搜索）】→ 进入结果页面 → 点击【查看结果】会直接下载结果 → 打开文件 → 查找并标记作者选择的5个药物。

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pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取药物结构并展示，我们以Clemizole为例。

1. 文本框输入clemizol → 点击搜索图标 → 进入clemizol信息页面，第一个就是我们想要找的，点击进入 →

2. Clemizole详细信息页面，有pubchem CID（ID号），结构展示（作者向我们展示的是3D结构），分子式等

Bacitracin结构暂时没有，其它3个药物可以用相同的方式在pubchem数据库验证。

最后，我们来看下table，table的信息来自于图片，作者把同一个结果分别用图和表分别表示，花样展示数据。

Table1 即Fig.5 生存分析的结果

Table2 Fig6 cytohubba计算结果的排名及score

Table 3 药物预测结果展示 为Fig.10的补充

总结

1. 作者共使用了12个在线数据库和R语言来给我们展示了一篇具有丰富结果的ceRNA纯生信文章。从分析策略上来看，本文始终围绕着【挑圈联靠】进行，我们直接上图：

2. 整个流程下来，除了TCGA-GBM tpm数据差异分析，ceRNA基因预测和Cytoscape，其它部分【仙桃】均能实现，一站式搞定哟。

好啦！我们完美地复现了一篇ceRNA的文章，是不是没有想象中那么难了，快快行动起来吧。